難培養微生物研究の最新技術II　―ゲノム解析を中心とした最前線と将来展望―

Current Technology and Perspectives for Yet-uncultivated Microbial Resources

【第1編　難培養微生物の研究技術】
第1章　微小空間における難培養微生物群集の構造と機能解析（岡部聡）
　　1.　はじめに
　　2.　微生物群集構造の解析技術
　　3.　微小空間での微生物群集機能解析技術
　　4.　群集レベルでの機能解析
　　5.　微小電極
　　6.　微小電極の種類
　　　6.1　ポーラログラフィー原理に基づく方法
　　　6.2　特定イオンを選択的に通過させる膜に生じた膜電位を測定する方法
　　　6.3　電極反応により生じた起電力を測定する方法
　　7.　濃度分布の解析
　　8.　微小電極の限界
　　9.　微小電極を用いた解析例
　　10.　Anammox細菌バイオフィルム
　　11.　メタン発酵グラニュール
　　12.　細胞レベルでの機能解析
　　13.　MAR-FISHの手順
　　14.　MAR-FISHの問題点
　　15.　MAR-FISHを用いた解析例
　　16.　おわりに
第2章　生細胞内RNA検出のための化学反応プローブ（古川和寛，阿部洋，伊藤嘉浩，常田聡）
　　1.　はじめに
　　2.　Fluorescence in situ hybridization（FISH）法
　　3.　蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を利用した生細胞内RNA検出
　　　3.1　FRET法
　　　3.2　モレキュラービーコン（MB）法
　　　3.3　化学連結法
　　4.　蛍光発生分子を利用した生細胞内RNA検出法
　　5.　まとめ
第3章　Stable Isotope Probing法とその応用（堀知行）
　　1.　はじめに
　　2.　Stable Isotope Probing法の原理と実施手順
　　　2.1　安定同位体基質を用いた培養
　　　2.2　核酸の抽出
　　　2.3　密度勾配遠心と分画
　　　2.4　分子フィンガープリント解析
　　　2.5　クローン解析
　　3.　Stable Isotope Probing法の適用例
　　　3.1　13C-acetate Probingを用いた水田土壌における鉄還元細菌の同定
　　　3.2　SIP法を用いた生物間食物連鎖の解析
　　4.　Stable Isotope Probing法の技術的進展と応用
　　　4.1　15N-SIPと18O-SIP
　　　4.2　Protein-SIP
　　　4.3　DNA-SIPとメタゲノム解析の融合法
　　5.　おわりに
第4章　核酸に基づく複合微生物群中の特定微生物群の定量分析法（関口勇地）
　　1.　はじめに
　　2.　核酸を対象とした微生物の定量法：定量的核酸増幅法
　　3.　DNAを標的とした簡便な微生物定量法：HOPE法
　　4.　RNAを標的とした簡便な微生物定量法：rRNA配列特異的切断法
　　5.　おわりに
第5章　統計学的微生物群集構造の解析（本郷裕一，大熊盛也）
　　1.　はじめに
　　2.　SSU rRNA遺伝子の取得と配列解析におけるポイント
　　　2.1　サンガー法による配列解析を行う場合
　　　2.2　パイロシーケンス法による配列解析を行う場合
　　3.　統計学的解析
　　　3.1　キメラチェック
　　　3.2　整列（アラインメント）
　　　3.3　OTU（operational taxonomic unit，phylotype）への分類
　　　3.4　分子系統解析
　　　3.5　種数推定と多様性比較
　　　3.6　種（系統）構成による群集間の比較
　　　　3.6.1　群集構造の有意差検定
　　　　3.6.2　群集間の類似度解析
　　4.　おわりに
第6章　SIGEX：メタゲノムからのハイスループットな代謝系遺伝子スクリーニング法（内山拓）
　　1.　はじめに
　　2.　メタゲノムのスクリーニング：従来法とSIGEX法
　　3.　SIGEX法の開発と実施
　　4.　SIGEX法の有用性と限界
　　5.　おわりに
【第2編　難培養微生物のゲノム・メタゲノム解析】
第7章　次世代シークエンサーを用いたゲノム解析とメタゲノム解析（大島健志朗，服部正平）
　　1.　はじめに―次世代シークエンサーについて―
　　2.　細菌ゲノム解析研究への活用
　　3.　マイクロバイオーム計画
　　4.　メタゲノム解析
　　5.　個別ゲノム解析（リファレンスゲノム解析）
　　6.　おわりに
第8章　メタゲノムインフォマティクス（森宙史，丸山史人，黒川顕）
　　1.　メタゲノム解析とは
　　2.　メタゲノム解析の目的
　　3.　メタゲノムインフォマティクス
　　　3.1　メタゲノム解析手法
　　　3.2　ゲノムマッピング
　　　3.3　遺伝子機能アノテーション
　　　　3.3.1　フィルタリング
　　　　3.3.2　アッセンブルを伴う遺伝子アノテーション
　　　　3.3.3　遺伝子予測
　　　　3.3.4　アッセンブルを伴わない遺伝子アノテーション
　　　　3.3.5　遺伝子機能アノテーション
　　　3.4　統計的補正
　　　3.5　遺伝子数の統計的補正
　　4.　メタデータの重要性
　　5.　おわりに
第9章　ヒト腸内フローラのメタゲノム解析と肥満・健康（桑原知巳，林哲也）
　　1.　はじめに
　　2.　健常人の腸内フローラメタゲノム解析
　　3.　腸内フローラと肥満
　　　3.1　遺伝子改変マウスを用いた解析
　　　3.2　成人での検討
　　　3.3　双子を対象とした解析
　　　3.4　フローラ内での菌種間相互作用（ノトバイオートマウスを用いた解析）
　　4.　おわりに
第10章　環境オミクスによる地下生命圏の探索（布浦拓郎）
　　1.　地下生命圏（地殻内生命圏）とは
　　　1.1　地下生命圏の概観
　　　1.2　活動的な地下生命圏と微生物多様性のボトルネック効果
　　2.　活動的地下生命圏における環境オミクス解析
　　　2.1　活動的地下生命圏と環境オミクス解析
　　　2.2　カリフォルニア鉱山酸性排水微生物群集
　　　2.3　南アフリカ金鉱山地下環境における微生物生態研究
　　　2.4　地下鉱山熱水環境における微生物生態研究
　　　2.5　嫌気的メタン酸化微生物群集
　　3.　複雑な海底下生命圏解明に向けて
第11章　植物根圏微生物群集（海野佑介，信濃卓郎）
　　1.　植物根圏とそこに棲む微生物
　　2.　植物根圏微生物群集への取組み
　　3.　根圏メタゲノム解析研究の現状
第12章　化学合成生態系の無脊椎動物-微生物間細胞内共生系からみた共生菌のゲノム縮小進化（吉田尊雄，髙木善弘，島村繁，丸山正）
　　1.　化学合成生態系の共生系とは
　　2.　化学合成生態系の共生菌のゲノム解析の現状
　　3.　世界最小ゲノムサイズの独立栄養微生物のゲノム―シロウリガイ類共生菌のゲノム解析からわかったこと―
　　4.　細胞内共生菌のゲノム縮小進化メカニズム―比較ゲノム比較解析からの推察―
第13章　Single Cellのゲノム解析（本郷裕一，大熊盛也）
　　1.　シングルセル・ゲノミクスとは
　　2.　Phi29 DNA polymeraseと等温全ゲノム増幅
　　3.　等温全ゲノム増幅の実際
　　　3.1　等温全ゲノム増幅の基本プロトコル
　　　3.2　等温全ゲノム増幅の問題点と対策
　　　　3.2.1　DNAのコンタミネーション
　　　　3.2.2　非特異的増幅
　　　　3.2.3　増幅バイアス
　　　　3.2.4　キメラ生成
　　4.　増幅産物の配列解析
　　5.　細胞単離・回収法
　　　5.1　マイクロマニピュレーションによる細胞回収
　　　5.2　セルソーター（FACS）による細胞回収
　　6.　実際の研究例
　　　6.1　シロアリ腸内原生生物の細胞内共生細菌ゲノムの取得と解析
　　　6.2　口腔中の未培養細菌種の単一細胞からのゲノム解析
　　　6.3　海洋性未培養細菌種の単一細胞からのゲノム解析
　　7.　おわりに
第14章　微生物群集のメタボローム統合化解析（菊地淳，守屋繁春，福田真嗣，大野博司）
　　1.　はじめに
　　2.　環境メタボローム解析の世界動向と技術開発
　　3.　メタボローム情報からの遺伝子機能解析―シロアリ共生系のEST情報を活用したバイオマス分解酵素の探索―
　　4.　複合微生物系の代謝動態解析―ヒト等哺乳類の腸内環境改善を目指して―
【第3編　難培養微生物の機能と応用】
第15章　メタン発酵―ゲノム解析から明らかになった共生細菌の進化と生存戦略―（下山武文，渡邉一哉）
　　1.　はじめに
　　2.　メタン発酵における共生現象
　　3.　ゲノム解析から見えてきた共生系の進化機構
　　4.　共生系形成の分子メカニズム
　　5.　おわりに
第16章　アナモックス細菌の生態と応用（吉永郁生）
　　1.　はじめに
　　2.　アナモックスの発見と研究の歴史
　　3.　アナモックス活性の検出
　　4.　アナモックス細菌の集積
　　5.　アナモックス細菌の形態的特徴とラダーラン脂質
　　6.　アナモックス細菌の生理
　　　6.1　アナモックス代謝とエネルギー生産
　　　6.2　アナモックス細菌の炭酸同化
　　　6.3　アナモックス細菌の多様な生き様
　　7.　アナモックス細菌の生態と環境における重要性
　　　7.1　海洋環境のアナモックス
　　　7.2　淡水環境と陸域のアナモックス
　　　7.3　アナモックス細菌群集の種組成
　　8.　アナモックス細菌の応用
　　9.　おわりに
第17章　水田土壌で機能する脱窒細菌群集の土壌DNAに基づく特定とSingle-Cell Isolation（妹尾啓史，石井聡）
　　1.　はじめに
　　2.　Stable Isotope Probing（SIP）法による脱窒細菌群集構造解析
　　3.　16S rDNA大量シーケンスによる脱窒細菌群集構造解析
　　4.　nirS，nirK解析による脱窒細菌の多様性と変動解析
　　5.　Functional Single-Cell（FSC）分離法による水田土壌からの脱窒細菌の単離・同定
　　6.　おわりに
第18章　嫌気的脱ハロゲン化と環境保全（片山新太）
　　1.　残留性の高い有機ハロゲン化合物
　　2.　嫌気微生物による脱ハロゲン化反応
　　3.　嫌気性脱ハロゲン化微生物
　　4.　脱ハロゲン化微生物の培養方法
　　5.　嫌気性脱ハロゲン微生物によるバイオレメディエーション
　　6.　おわりに：今後への展望
第19章　環境汚染物質分解細菌のメタゲノミクス（永田裕二，津田雅孝）
　　1.　はじめに
　　2.　培養非依存的手法による環境汚染物質分解酵素遺伝子の取得
　　　2.1　メタゲノムからの特定の機能遺伝子の取得法
　　　2.2　機能ベースの方法による環境汚染物質分解酵素遺伝子の取得
　　　2.3　シークエンスベースの方法による環境汚染物質分解酵素遺伝子の取得
　　3.　おわりに
第20章　昆虫細胞内共生細菌―その機能と応用―（土'田努）
　　1.　はじめに
　　2.　細胞内共生細菌の種類
　　　2.1　必須の栄養共生細菌
　　　2.2　任意共生細菌
　　3.　必須の複合共生系
　　4.　共生細菌が宿主昆虫に与える影響
　　　4.1　環境温度への適応
　　　4.2　餌環境への適応
　　　4.3　ウイルス伝播
　　　4.4　天敵からの宿主の防御
　　　4.5　宿主の性を操る
　　5.　共生細菌を対象とした応用技術
　　　5.1　共生細菌を標的にした害虫管理技術
　　　5.2　昆虫媒介性病原体の共生細菌を利用した駆除
　　　5.3　生殖を操作する共生細菌を用いた害虫防除，有用系統の作出
　　　5.4　共生細菌遺伝子組換え植物による植物病原ウイルスの防除
　　　5.5　共生細菌由来有用物質の活用
　　6.　おわりに
第21章　難培養微生物と創薬リード探索（山本英作，江崎正美）
　　1.　微生物由来の創薬リード化合物探索
　　2.　難培養微生物が作る生理活性物質
　　3.　放線菌集落内に生育する嫌気性細菌
　　　3.1　共生する嫌気性細菌の発見
　　　3.2　Sporotalea colonica SYB株が産生する新規抗生物質 naphthalecin
　　　3.3　共培養とnaphthalecin産生
　　　3.4　Sporotalea colonica SYB株の共生（寄生）機構
　　　3.5　創薬リード探索にむけて
　　4.　おわりに
第22章　食品・環境と難培養性微生物（重松亨）
　　1.　はじめに
　　2.　食品中の難培養性微生物
　　3.　液体培養と固体培養
　　4.　液体培養に基づく微生物叢の解析
　　5.　将来展望
【第4編　微生物資源としての難培養微生物】
第23章　難培養微生物の培養技術（鎌形洋一）
　　1.　はじめに
　　2.　微生物の多様性と未知微生物・難培養微生物
　　3.　難培養性微生物とは
　　　3.1　生育速度が著しく遅い微生物
　　　3.2　寒天でコロニーを形成しない微生物
　　　3.3　生育に一定以上の細胞濃度を必要とする微生物
　　　3.4　濁度として検知できない細胞数レベルで静止期を迎えてしまう微生物
　　　3.5　他の微生物が生産する生育因子を必要とする微生物
　　　3.6　種間水素伝達を行う共生微生物
　　　3.7　昆虫や動物などに共生する微生物
　　　3.8　そもそも環境中で非優占的な微生物
　　4.　難培養・未知微生物を培養する技術
　　　4.1　今なお有効な古典的分離培養手法（限界希釈やゲル化剤）
　　　4.2　原位置培養手法
　　　4.3　生育因子や環境因子に基づく分離培養手法
　　　4.4　共生培養法
　　　4.5　分離培養のためのハイスループットテクノロジー
　　5.　あらためて難培養性微生物の培養技術とは
第24章　新規・未知微生物の分離培養（森浩二）
　　1.　はじめに
　　2.　微生物の多様性
　　　2.1　培養微生物
　　　2.2　未培養微生物
　　3.　分類学的に高次な分類群が提案された分離株
　　　3.1　Gemmatimonas aurantiaca（Gemmatimonadetes門，KS-B）
　　　3.2　Victivallis vadensisとLentisphaera araneosa（Lentisphaerae門，VadinBE97）
　　　3.3　“Elusimicrobium minutum”（“Elusimicrobia”門，Termite group 1）
　　　3.4　Caldisericum exile（Caldiserica門，OP5）
　　　3.5　“Nitrosopumilus maritimus”（“Nitrosopumilales”目，Marine group 1）
　　　3.6　Methanocella paludicola（Methanocellales目，Rice cluster 1）
　　4.　おわりに
第25章　難培養性微生物とカルチャーコレクション（伊藤隆）
　　1.　はじめに
　　2.　カルチャーコレクションのミッション：資源戦略の面から
　　3.　カルチャーコレクションのミッション：学術的な面から
　　4.　カルチャーコレクションの現状
　　5.　難培養性微生物リソースの取り扱い
　　　5.1　培養容器の問題
　　　5.2　水の問題
　　　5.3　培地成分の問題
　　　5.4　微生物取り扱い操作の問題
　　6.　難培養微生物リソースの利用促進に向けて
　　7.　メタゲノムリソースの取り扱い
　　8.　おわりに
第26章　難培養微生物研究の将来像（大熊盛也）
　　1.　難培養微生物研究の黎明からゲノムの時代へ
　　2.　メタゲノム解析の現状と将来
　　3.　微小生態学的と共生
　　4.　難培養微生物の資源化
　　5.　難培養微生物研究の潮流